چکیده

یکی از چالش های عمده پرورش دهندگان جوجه های گوشتی، بیماری های ویروسی از جمله نیوکاسل و آنفلوانزا می باشد که همه ساله خسارت های فراوانی را به صنعت مرغداری در سراسر دنیا وارد می کند. در این مطالعه به بررسی میزان تلفات ناشی از شیوع این دو بیماری ویروسی در گله های طیور گوشتی شهرستان شهرکرد از طریق آزمایشات  HI  وRT-PCR  پرداخته شده است.   در این بررسی با انتخاب ۱۵ گله دارای تلفات اقدام به اخذ نمونه خون در دو نوبت (نوبت اول در شروع بیماری و نوبت دوم به فاصله ۱۴ روز بعد از بیماری) و انجام تست   HI  گردید. با توجه به میانگین تیتر آنتی بادی در دو نوبت نمونه گیری و مقایسه آنها با یکدیگر، در آزمایش HI، تعداد ۸ گله ۵۳/۳۳ %) ) دارای عیار آنتی بادی ضد ویروس آنفلوانزا سویه H9N2 و تعداد ۹ گله(۶۰ %) دارای عیار آنتی بادی ضد ویروس نیوکاسل بودند. نتایج آزمایش RT-PCR نشان داد تمام ۱۵ گله دارای ویروس نیوکاسل(اعم از سویه های بیماری و سویه واکسینال) می باشند. از نظر آنفلوانزا ۱۱ گله مثبت شدند. در بررسی اختصاصی،  جهت تعیین پاتوتیپهای ویروس نیوکاسل، بوسیله پرایمرهای  VLTe  , AVLTe (ولوژن و غیر ولوژن)۳۳/۳  درصد گله ها آلوده به سویه ولوژن و۶۶/۶  درصد گله ها آلوده به سویه های غیر ولوژن(شامل سویه های مزوژن و یا واکسینال) بودند.  بررسی ویروس های آنفلوانزا با استفاده از پرایمرهای اختصاصی  H9N2  و  H5N1  نشان داد که تمامی ویروس ها، متعلق به تیپ H9N2 بودند.  بر اساس نتایج این تحقیق، میزان تلفات ناشی از کمپلکس بیماریهای آنفلوانزا سویه H9N2 و نیوکاسل سویه مزوژن با ۶۲ درصد در الویت اول و نیوکاسل سویه ولوژن با ۳۲ درصد در الویت دوم قرار دارد. خسارت ناشی از سایر بیماری ها ۶ درصد است.

کلمات کلیدی: میزان تلفات، ویروس نیوکاسل، ویروس آنفلوانزا(H9N2)، کمپلکس بیماری، طیور گوشتی، HI ، RT-PCR

مقدمه :

دو بیماری نیوکاسل و آنفلوانزا از دیر باز یکی از عوامل اصلی تلفات طیور در اکثر کشورها بوده اند. عامل بیماری نیوکاسل ویروسی از خانواده پارامیکسوویریده جنس اوولاویروس که اسید هسته ای آن RNA با سنس منفی می باشد و عامل بیماری آنفلوانزا ویروسی از خانواده ارتومیکسوویریده جنس آنفلوانزا که اسید هسته ای آن RNA هشت قطعه ای با سنس منفی است(Saif et al.,2003; Alexander, 1999 ). این دو بیماری هر سال خسارات جبران ناپذیری به صنعت طیور کشورهای مختلف وارد می کنند. علائم این دو بیماری به صورت تحت بالینی یا عفونت خفیف دستگاه فوقانی تنفس تا بیماری حاد و کشنده می توانند متفاوت باشد. عوامل متعددی همچون استرس های محیطی، عفونتهای همزمان، سن پرنده و ایمنی مادری می تواند نتیجه عفونت را تحت تاثیر قرار دهد. این دو بیماری در صورت ابتلا می توانند تا ۱۰۰ درصد باعث مرگ و میر شوند. از راههای مبارزه با این دو بیماری، جلوگیری از ورود ویروس به مزرعه، جداسازی پرندگان حساس از پرندگان آلوده، عدم تماس پرندگان حساس با پرندگان بهبود یافته، واکسیناسیون و درمانهای حمایتی را می توان نام برد(Saif et al., 2003; Jordan et al.,  ۲۰۰۱). در بررسیهای متعدد وجود ویروس نیوکاسل در اکثر پرندگان اهلی و وحشی در اکثر نقاط دنیا گزارش شده است. بیماری آنفلوانزای طیور سویه(H9N2) نخستین باردر خرداد ۱۳۷۷ در مرغداری های اطراف تهران و قزوین دیده شد که عامل آن توسط موسسه رازی و دانشکده دامپزشکی تهران جدا و به ترتیب به اسامی A/chicken/Iran/ZMT/101/1377 و A/chicken/Iran/259/1377  نام گذاری شدند(Vasfi Marandi and Bozorgmehri Fard, 2002 ; Nili and Asasi, 2003 ). با توجه به اندمیک بودن این دو بیماری در برخی از کشورها از جمله ایران، مطالعات زیادی در خصوص این دو بیماری بصورت مجزا در کشور انجام گرفته است ولی این دو بیماری تاکنون از نظر برآورد خسارت اقتصادی بصورت همزمان مورد بررسی قرار نگرفته اند. لذا در مطالعه حاضر برآورد خسارت این دو بیماری مورد بحث قرار گرفته است.

مواد و روش کار

این مطالعه بصورت مقطعی و در فصل پاییز ۱۳۸۹ انجام شد، بدین صورت که ابتدا پس از دریافت گزارش تلفات از طرف مسئولین فنی مرغداریها، به محل مورد نظر مراجعه نموده و پس از اخذ تاریخچه(شامل برنامه واکسیناسیون، برنامه غذایی، تاریخ شروع تلفات، تعداد تلفات، روند صعودی یا نزولی بودن تلفات و ثبت علائم کلینیکی) اقدام به نمونه گیری های بافتی (نای و سکال تانسیل) و سرمی در دو نوبت می شد، بطوریکه از هر واحد ۱۰۰۰۰ قطعه ای ، تعداد ۱۲ عدد نمونه خون و ۷ عدد نمونه بافتی اخذ گردید و تمامی نمونه ها در کنار یخ و در حداقل زمان به  آزمایشگاه انتقال داده شد. پس از انتقال نمونه ها به آزمایشگاه، نمونه های سرمی و بافتی کد گذاری شده و منجمد گردیدند و در پایان مرحله نمونه برداری، مورد آزمایش HI  وRT-PCR  قرار گرفتند. نمونه های خون پس از جداسازی سرم، تحت آزمایش ممانعت از هماگلوتیناسیون(HI) قرار گرفتند تا از نظر تیتر آنتی بادی ضد ویروس های آنفلوانزا(H9N2 وH5N1) و نیوکاسل کنترل شوند و در پایان نتایج بدست آمده مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار  گرفت. در آزمون HI آن دسته از گله هایی که تیترآنتی بادی بالای ۲ داشتند و همچنین تیتر آنتی بادی آنها در نوبت دوم خونگیری نسبت به نوبت اول روند صعودی داشت مثبت و گله هایی که تیترآنتی بادی آنها زیر عدد ۲ و در خونگیری نوبت دوم نسبت به اول روند نزولی داشت منفی در نظر گرفته شدند.

آزمونRT-PCR

استخراج RNA و تخلیص آن با کیت تخلیص ساخت شرکت Roch و هموژنیزه کردن نمونه ها با Tris Hcl و SDS انجام شد. مراحل انجام  RT-PCR بدین شرح بود: ۱- تهیه ماده مسترمیکس (cDNA) با استفاده از کیت کیاژن، پرایمرهای اختصاصی و آنزیم .Taq DNA Polymerase 2-  قراردادن لوله حاوی مسترمیکس در دستگاه اپندورف با سیکل دمایی ۳۰/۵۰ و ۱۵/۹۵ و ۱۰/۷۲ (درجه/دقیقه). ۳- الکتروفورز در محیط ژل  ۲% آگارز جهت ردیابی محصول   PCR بهمراه مارکر ۱۰۰pb ساخت شرکت فرمنتاز و در ولتاژ ۱۲۰ بمدت ۴۵ دقیقه. در آزمایش  RT-PCR ابتدا نمونه های بافتی نای و سکال تانسیل پس از استخراج RNA توسط پرایمرهای عمومی شرکت سیناکلون از نظر گروه ویروس ها مورد بررسی قرار گرفتند، بطوریکه در مورد نیوکاسل تمامی نمونه ها توسط پرایمرهای عمومی گروه نیوکاسل مورد بررسی قرار گرفتند که در هر ۱۵ گله ویروس نیوکاسل ردیابی شد. در مرحله دوم نمونه ها توسط پرایمرهای اختصاصی VLTe  , AVLTe مورد بررسی قرار گرفتند.(Astrid et al., 2008)

جدول شماره ۱ : پرایمرهای اختصاصی و عمومی مورد استفاده جهت تکثیر ژن ویروس نیوکاسل

جدول شماره ۲: پرایمرهای اختصاصی و عمومی مورد استفاده جهت تکثیر ژن ویروس آنفلوانزا

در خصوص بیماری آنفلوانزا تمام نمونه ها از طریق پرایمر تیپ A مورد بررسی قرار گرفتند و موارد مثبت جهت تعیین سویه، جدا شد و در مرحله دوم RT-PCR توسط پرایمرهای اختصاصی سویه های H9N2  و  H5N1 مورد بررسی قرار گرفتند(.(Monne et al., 2008

تجزیه و تحلیل آماری

پس از بدست آمدن نتایج، ابتدا داده ها در نرم افزار Excel جمع آوری و طبقه بندی گردید سپس با استفاده از نرم افزار آماری Spss نسخه ۱۱/۵ مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. در این نرم افزار ابتدا مقادیر میانگین و انحراف معیار عیار آنتی بادی در گله ها محاسبه شد و سپس ضریب پراکندگی (CV) در هر گله بدست آمد. در ادامه با توجه به موارد مثبت و منفی نتایج آزمایشات HI و PCR با استفاده از روش آماری غیرپارامتریک Chi-square و t-test گروهها در سطح (P<0/05)  مورد بررسی آماری قرار گرفتند.

نتایج

آن دسته از گله هایی که میانگین تیتر آنتی بادی آنها بالای ۲ بود و در آزمایش نوبت دوم نسبت به نوبت اول روند صعودی داشتند، مثبت قلمداد شدند و آن دسته که تیتر آنتی بادی آنها زیر عدد ۲ بود و در آزمایش دوم نسبت به نوبت اول روند نزولی داشتند، منفی تلقی گردیدند. در آزمایش HI  با توجه به میانگین تیتر آنتی بادی بدست آمده در دو نوبت نمونه گیری و مقایسه آنها با یکدیگر، در خصوص آنفلوانزا ۵۳/۳۳  درصد گله ها و در مورد نیوکاسل، ۶۰ درصد گله ها دارای تیتر آنتی بادی ضد ویروس بالای ۲ بودند. همچنین ۴۰ درصد گله ها نیز از نظر وجود هر دو آنتی بادی بطور همزمان مثبت بودند(نمودار ۱).

 از بین ۱۵ گله مورد بررسی از نظر آزمایش HI فقط ۴ گله (۶/۶۶ درصد) از نظر وجود تیتر آنتی بادی ضد ویروس نیوکاسل و آنفلوانزا منفی بودند. در نتایج بدست آمده از آزمایش  RT-PCR 100 درصد گله ها از نظر ویروس نیوکاسل و ۷۳/۳۳ درصد گله ها از نظر ویروس آنفلوانزا سویه(H9N2) و  ۷۳/۳۳ گله ها از نظر وجود هر دو ویروس بطور همزمان مثبت بودند( نمودار۱).

 

نمودار۱: مقایسه نتایج موارد مثبت بیماری نیوکاسل و آنفلوانزا در آزمایش HI و PCR

در بررسی اختصاصی پاتوتیپهای ویروس نیوکاسل بوسیله پرایمرهای VLTe  , AVLTe (ولوژن و غیر ولوژن ) ۳۳/۳۳ درصد گله ها آلوده به سویه ولوژن و ۶۶/۶۶ درصد گله ها آلوده به سویه های غیر ولوژن )شامل سویه های مزوژن و یا واکسینال ) بودند. ویروس آنفلوانزا از طریق  پرایمرهای اختصاصیH9N2  و H5N1 مورد بررسی قرار گرفتند که تمام موارد مثبت مربوط به سویه  H9N2 بود.

در بررسی میزان تلفات، پس از شمارش تعداد تلفات، مشخص شد ۶۲ درصد تلفات مربوط به گله های است که به طور همزمان درگیر کمپلکس بیماریهای نیوکاسل سویه مزوژنیک و آنفلوانزا سویه H9N2 شده اند و ۳۲ درصد تلفات مربوط به شیوع بیماری نیوکاسل سویه ولوژنیک بوده است و ۶ درصد تلفات، مربوط به سایر بیماریهاست.

 

نمودار۲: در صد خسارت ناشی از  بیماری های نیوکاسل و آنفلوانزا(H9)  در گله های مورد بررسی

بحث

دو بیماری نیوکاسل و آنفلوانزا(H9) از بیماری های بسیار مسری و مهم در پرندگان و طیور گوشتی می باشند که همه ساله موجب تلفات زیاد و خسارت اقتصادی فراوانی به صنعت پرورش طیور در سراسر جهان می شوند. در کشور ما نیز این دو بیماری از اولویت های اول در ایجاد مرگ و میر در طیور گوشتی می باشند. تا کنون مطالعات گسترده ای در خصوص میزان شیوع این دو بیماری در دنیا انجام شده است .فتحی در سال ۲۰۰۷ با بررسی ۱۳ گله مشکوک به بیماری نیوکاسل در استان چهارمحال و بختیاری با انجام آزمایشات HI  وRT-PCR وکشت ویروسی در تخم مرغهای SPF به این نتیجه رسید که در روش PCR ، همه گله ها دارای ویروس نیوکاسل و ۴ گله از ۱۳ گله آلوده به ویروس فوق حاد نیوکاسل و در آزمایش HI %84/6 نمونه ها دارای آنتی ژن ضد ویروس نیوکاسل بودند(.(Fathi, Hafshejani, 2007 رحیمیان در سال ۲۰۱۱ در استان اصفهان با بررسی ۳۷  گله مشکوک به نیوکاسل اعلام کرد تمام گله ها، حاوی ویروس نیوکاسل بودند که از بین آنها ۴ گله از نظر فرم ولوژنیک مثبت بود(.(Rahimian, 2011

در بررسی حاضر نیز نتایج مشابهی بدست آمد بطوریکه در روشPCR  هر ۱۵ گله از نظر ویروس نیوکاسل مثبت و ۵ گله آلوده به سویه ولوژن ویروس نیوکاسل بود و در روش HI %60 گله ها از نظر وجود آنتی بادی ضد ویروس نیوکاسل مثبت بودند. محمدی درویش وند(۱۳۸۶)  در بررسی ۵۰  گله طیور گوشتی در استان اصفهان و چهارمحال به این نتیجه رسید که از ۱۷ گله آلوده به آنفلوانزا تیپ A ، ۱۲ گله آلوده به سویه H9N2  بوده است و البته هیچ کدام از این ۱۷ گله به سویه H5N1 آلوده نبودند .(Darvishvand, 2007 Mohamadi) نیکخواه (۱۳۸۸)در مطالعه طیور کشتار شده کاشان به این نتیجه رسید که از ۲۰ گله غیر واکسینه مورد بررسی، ۱۷ گله از نظر آنفلوانزا سویه H9N2 مثبت هستند و ۵/۸۲ درصد گله های غیر واکسینه دارای آلودگی به آنفلوانزا و نوموویروس هم بودند(Nikkhah, Ghamsary, 2009). درسال ۲۰۰۹ درموزامبیک بیشترین خسارت در طیور روستایی ناشی از ویروسهای حاد نیوکاسل گزارش شد و همچنین میزان شیوع بیماری آنفلوانزا در مرغهای صنعتی پاکستان نیز در محدوده ۱۰-۲۰ درصد گزارش شده است (Naeem et al., 1999 ;  Naeem et al, 2003). کمالی پور ( ۱۳۸۶ ) در گله های گوشتی در شهرستان رامهرمز میزان شیوع تیتر آنتی بادی ضد ویروس آنفلوانزا را ۶۰ درصد گزارش کرد (. (Kamalipur, 2007

در مصر میزان شیوع سویه های حاد ویروس آنفلوانزا ۷۵ – ۲۸/۸ درصد در اردک و ۵۳/۳-۸۳/۳ درصد در گله های مرغ و در ارتباط با نیوکاسل از ۳۳/۳-۹۴/۴ درصد گزارش شده است(Aly et al., 2009).

در مطالعه حاضر که بطور همزمان دو بیماری نیوکاسل و آنفلوانزا در ۱۵ گله گوشتی دارای تلفات مورد بررسی قرار گرفت، در روش RT-PCR ، ۷۳/۳ % گله ها و در روش HI ، ۴۰ % گله ها بطور همزمان از نظر ویروس نیوکاسل و آنفلوانزا مثبت بودند. همچنین در تست HI پس از دو بار خونگیری و آزمایش، ۵۳/۳۳ % گله ها از نظر آنتی بادی ضد ویروس آنفلوانزا(H9N2) مثبت و در روش RT-PCR ، ۷۳/۳۳ % همین سویه مثبت بودند و اختلاف آماری معنی داری در مقایسه نتایج این دو روش، در سطح P<0/05  وجود دارد. در این بررسی همه گله ها از نظر سویه H5N1 آنفلوانزا منفی بودند. در بررسی اختصاصی پاتوتیپهای ویروس نیوکاسل، بوسیله پرایمرهای  VLTe  , AVLTe (ولوژن و غیر ولوژن) ۳۳/۳ درصد گله ها آلوده به سویه ولوژن و ۶۶/۶ درصد گله ها آلوده به سویه های غیر ولوژن (شامل سویه های مزوژن و یا واکسینال( بودند. با توجه به نتایج این تحقیق و سایر محققین از جمله Fathi (2007) و Rahimian (2011) که در یک منطقه جغرافیایی انجام گردیده می توان چنین نتیجه گرفت که سویه های ولوژن ویروس نیوکاسل جدا شده در این تحقیق می توانند مشابهت زیادی با سویه های جدا شده در دو تحقیق فوق داشته باشند. همچنین با مقایسه نتایج حاصل از این تحقیق و بررسیهای سایر افراد که در مناطق مختلف انجام شده، مشخص می گردد که سویه های حاد ویروس نیوکاسل در برخی از کشورها مانند ایران سبب خسارات مهمی در صنعت طیور میشوند و از شیوع بالایی نیز برخودار هستند و هرگاه در گله ای کمپلکس دو بیماری نیوکاسل و آنفلوانزا رخ دهد تلفات شدیدتر میشود همچنان که در این تحقیق ۶۲ درصد تعداد تلفات، مربوط به گله هایی است که بطور همزمان درگیر کمپلکس دو بیماری شده اند.  بنابراین می توان گفت این مطالعه با تحقیقات انجام گرفته همخوانی دارد .اما عدم جداسازی سویه های فوق حاد ویروس آنفلوانزا در این مطالعه در مقایسه با برخی مناطق همخوانی نشان نمی دهد با تجزیه و تحلیل نتایج بدست آمده و تاریخچه گله های تحت مطالعه می توان علت اصلی تلفات را در ۵ گله، سویه ولوژن ویروس نیوکاسل و در ۹ گله دیگر ویروس آنفلوانزا (سویه H9N2) و یا ترکیبی از ویروس آنفلوانزا (H9N2 ) و سویه های مزوژن نیوکاسل دانست و عامل تلفات در دو گله چیزی غیر از نیوکاسل و آنفلوانزا بوده، و در مواردی که آلودگی همزمان دو بیماری نیوکاسل و آنفلوانزا وجود داشته است، شدت تلفات گله ها تحت مطالعه بیشتر بوده است.

دکتر اسماعیل دوستی۱ ، دکتر عزت الله فتحی هفشجانی۲ ، دکتر عبدالکریم زمانی مقدم۳

۱ دکترای عمومی دامپزشکی و کارشناس واحد مبارزه با بیماریهای طیور شبکه دامپزشکی شهرستان شهرکرد                                                                                                                                                ۲ گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران.

۳ گروه علوم درمانگاهی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران.

*نویسنده مسئول: doosty372@yahoo.com

منابع:

۱-    آواک، الف. و افشارپاد، ک. (۱۳۸۳).،بیماریهای طیور و پرندگان زینتی؛ انتشارات نیکخواه صفحه۱۸۷

۲-    حجازی، خ.، (۱۳۷۷). بررسی میزان شیوع و تیتر پادتن ضد ویروس نیوکاسل در گنجشکهای استان اصفهان، پایان نامه دکترای حرفه ای دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد شماره ۴۰

۳-    شاه ولی، محمد.، (۱۳۸۶). بررسی عیار پادتنی ضد ویروس آنفلوانزا تحت تیپ H9N2در مرغان گوشتی و افراد مرتبط در استان خوزستان؛ پایان نامه دکترای حرفه ای دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد شماره ۵۴۳

۴-    شیمی، الف.، (۱۳۷۵ ). ویروس شناسی دامپزشکی؛ انتشارات جهاد دانشگاهی تهران صفحه۳۵۷-۳۷۰

۵-    فتحی، ع.، (۱۳۸۶). جداسازی ویروس عامل بیماری نیوکاسل با استفاده از روشهای سرولوژی، ویروس شناسی و ملکولی در مرغداریهای گوشتی استان چهارمحال و بختیاری؛ پایان نامه تخصصی دکترای دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات

۶-    متقی، م.، (۱۳۸۱). بررسی سرولوژیکی بیماری آنفلوانزا در گنجشکان شهرستان شهرکرد؛ پایان نامه دکترای حرفه ای دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد شماره ۲۰۸

۷-    نقی، سیدعلی.، (۱۳۷۴). کلاسهای بازآموزی بیماریهای ویروسی طیور؛ انتشارات واحد آموزش وپژوهش معاونت کشاورزی سازمان اقتصادی کوثر، صفحات۹ ،۱۳۸و۱۴۴

۸-    نیکخواه قمصری، م.، (۱۳۸۸). بررسی شیوع سرمی پنوموویروس پرندگان در جوجه های گوشتی کشتار شده در شهر کاشان؛ پایان نامه دکترای حرفه ای دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد شماره ۶۱۴

۹-    وصفی مرندی، م.، (۱۳۷۹). اصول کنترل بیماری آنفلوانزای طیور؛ فصلنامه نظام دامپزشکی شماره اول

۱۰- Alexander, D.J., A rewire of avian influenza;Symposioum on animal influenza viruses, Gent, Beljium, 1999.

۱۱- Beard, C.W., avian influenza antibody detection by immune diffusion;  B.W.H.org., Vol.42,PP.779-785,1980.

۱۲- Calnek, B.W.,Diseases of poultry, 10.ed., , lowa State University press, 1997.

۱۳-Jirdan, F.T.W ;Patisson, m; Alexander, D. and Faragher, t ;Poultry diseases, 5 th  ed, W. B. Sanders, London 2001.

۱۴-Naeem k. Naurin, m. Rashid, S & bano, s. Seroprevalence avian influenza virus and its relation ship with increased mortality and decreased egg production, 2003.

۱۵-Nili, H. & Asasi, k.,  Avian Influenza(H9N2) outbreakin IRAN., 2003.

۱۶-Panigrahy, B., and Senner, D., Susceptibility of avian influenza. Avian diseases, Vol., 1999.

۱۷-Vasfi  Marandi, M. and Bozorgmehri Fard, M. H., Isolation of H9N2 subtype of avian influenza viruses during outbreak in chickens in iran, Iran-Biomed, Vol., 2002.

۱۸-Webester, R. G. & Hulse, D. Microbial adaptation and change avian influenza Rev. Sci. tech. Epiz., 2005.